Western Blot 實(shí)驗(yàn)應(yīng)該注意什么？
來源：本站 作者：jiyuanbio 時(shí)間：2025/2/19
Western Blot 實(shí)驗(yàn)是什么？
Western Blot 實(shí)驗(yàn)，又叫蛋白質(zhì)免疫印跡，是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法，在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域占據(jù)著舉足輕重的地位 。它就像是蛋白質(zhì)世界里的 “超級(jí)偵探”，能夠從復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中精準(zhǔn)地找出目標(biāo)蛋白。
在科研的眾多領(lǐng)域，比如生物醫(yī)學(xué)研究中，科學(xué)家們想要了解某種疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)變化，或者在藥物研發(fā)中，探究藥物對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，Western Blot 實(shí)驗(yàn)都能大顯身手。它主要有兩大關(guān)鍵作用，一是定性分析，判斷目標(biāo)蛋白是否存在；二是半定量分析，比較不同樣本中目標(biāo)蛋白表達(dá)量的相對(duì)高低 。比如在研究腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的差異時(shí)，通過 Western Blot 實(shí)驗(yàn)，就能知道某些與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的蛋白質(zhì)在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況，是腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量升高，還是正常細(xì)胞中表達(dá)量更高，從而為腫瘤的診斷和治療提供重要線索。
樣本制備：實(shí)驗(yàn)的基石
樣本制備是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)的開篇之作，其重要性如同基石之于高樓。這一步驟的成功與否，直接關(guān)系到后續(xù)實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行。只有制備出高質(zhì)量的樣本，才能為后續(xù)的蛋白質(zhì)分析提供可靠的基礎(chǔ)。
在樣本制備過程中，裂解液的選擇是首要關(guān)鍵。不同的蛋白質(zhì)定位需要不同的裂解液，就像不同的鎖需要不同的鑰匙。比如，對(duì)于全細(xì)胞蛋白的提取，NP-40、Triton X-100 或 RIPA 裂解液較為常用；而細(xì)胞質(zhì)（可溶）蛋白，Tris-HCl 裂解液更為合適 。一旦樣品開始裂解，蛋白降解、去磷酸化和變性也隨即開始，所以樣本裂解過程中要全程保持低溫（冰上或 4℃），所使用的試劑和耗材要提前預(yù)冷，并且裂解前幾分鐘要向裂解緩沖液中加入合適的酶抑制劑來減緩這些反應(yīng)。
樣本制備還有諸多注意事項(xiàng)。裂解液緩沖液 pH 值要合適，一般采用接近生理 pH 的緩沖液，如 Tris-HCl、PBS 等，pH 值太低或太高都有可能引起蛋白的變性、析出。蛋白提取時(shí)盡量保證不同樣品的鹽濃度一致，鹽離子濃度不一致會(huì)導(dǎo)致蛋白條帶寬窄不一；同時(shí)裂解液的鹽離子濃度不能太高，一般采用接近生理狀態(tài)的鹽離子濃度，防止蛋白鹽析；樣本鹽濃度比較高還會(huì)導(dǎo)致蛋白往兩邊擴(kuò)散，使得條帶越來越寬，最后條帶連在一起；也可能會(huì)導(dǎo)致泳道內(nèi)部電流偏大，最后出現(xiàn)笑臉的條帶。根據(jù)目的蛋白定位選擇合適的去垢劑裂解液，常見的去垢劑有 Triton X-100、NP40、SDS 等，不同的裂解液提取強(qiáng)度不同，其中 SDS 及其他離子型去垢劑的裂解液溶解能力最強(qiáng)，最有可能獲得最高的得率，但是會(huì)破壞蛋白 - 蛋白之間的相互作用，不適合 Co-IP 或者 Pull down 這類實(shí)驗(yàn)，如果想盡量保護(hù)蛋白 - 蛋白相互作用，避免蛋白變性，需要選擇溫和的非離子型去垢劑（例如 Triton X-100），或者直接用 Tris-HCl，PBS 這類不含去垢劑的緩沖液借助物理破碎提取可溶蛋白 。提取的樣本要盡可能新鮮，裂解前幾分鐘加相應(yīng)的酶抑制劑，提取時(shí)間要充足，提取全過程要保持低溫操作，使用的試劑和耗材要提前遇冷，提取后的樣本保存過程中要避免多次反復(fù)凍融。
凝膠制備：打造優(yōu)質(zhì)分離平臺(tái)
凝膠制備是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中至關(guān)重要的一環(huán)，它直接關(guān)乎到蛋白質(zhì)的分離效果，就如同搭建舞臺(tái)，只有舞臺(tái)搭建得穩(wěn)固、合適，后續(xù)的 “表演”（蛋白質(zhì)分離與檢測）才能精彩呈現(xiàn)。
在制備凝膠時(shí)，均一膠的制備尤為關(guān)鍵。要確保凝膠濃度均勻一致，這需要在配制過程中充分?jǐn)嚢韪鞣N試劑，讓它們完美融合。不同濃度的凝膠適用于不同分子量范圍的蛋白質(zhì)。低濃度的凝膠（如 5%），就像寬敞的大道，更適合大分子量的蛋白質(zhì)（大于 200 kDa）在其中遷移；中等濃度的凝膠（10%-12%）則像是城市里的主干道，通常用于分離中等分子量范圍的蛋白質(zhì)（25-200 kDa）；而高濃度的凝膠（15% 或更高）如同狹窄的小巷，適合分離小分子量的蛋白質(zhì)（小于 25 kDa） 。比如，當(dāng)我們研究的目標(biāo)蛋白是分子量較大的膠原蛋白時(shí)，就需要選擇低濃度的凝膠，讓它能夠在凝膠中順利遷移，與其他雜質(zhì)蛋白分離開來。
在制膠過程中，AP（過硫酸銨）和 TEMED（四甲基乙二胺）的用量控制是一個(gè)要點(diǎn)。AP 是引發(fā)劑，TEMED 是加速劑，它們共同作用促使丙烯酰胺聚合形成凝膠。用量過多，凝膠會(huì)迅速聚合，可能導(dǎo)致凝膠不均勻，還會(huì)產(chǎn)生過多的自由基，對(duì)蛋白質(zhì)造成損傷；用量過少，聚合速度過慢，甚至可能無法聚合。聚合時(shí)間的把控也不容忽視。聚合時(shí)間過短，凝膠未完全凝固，在后續(xù)電泳過程中容易變形，影響蛋白分離效果；聚合時(shí)間過長，凝膠會(huì)變脆，同樣不利于實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。一般來說，在室溫下，凝膠的聚合時(shí)間在 30 分鐘到 1 小時(shí)左右，不過具體時(shí)間還需根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。制膠時(shí)要隔絕氧氣，因?yàn)檠鯕鈺?huì)抑制凝膠的聚合，所以在灌膠后，通常會(huì)在膠液表面覆蓋一層水或異丙醇，形成一個(gè)無氧的環(huán)境，助力凝膠順利聚合。
電泳：蛋白分離的關(guān)鍵環(huán)節(jié)
電泳是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中分離蛋白的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它就像是一場精彩的賽跑，不同分子量的蛋白質(zhì)在電場的驅(qū)動(dòng)下，在凝膠這個(gè) “跑道” 上展開激烈角逐，從而實(shí)現(xiàn)分離。
在進(jìn)行上樣與電泳時(shí)，諸多要點(diǎn)需要牢記。為了實(shí)時(shí)觀察電泳進(jìn)程，判斷蛋白分子量大小，同時(shí)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)膜效果，使用預(yù)染蛋白 Marker 是個(gè)不錯(cuò)的選擇。比如，在研究某種未知蛋白質(zhì)時(shí)，通過預(yù)染蛋白 Marker，就能直觀地看到不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白在凝膠中的遷移位置，從而推測出未知蛋白的分子量范圍 。
上樣時(shí)，要盡量保證每個(gè)泳道的蛋白量一致，體積也盡量相同。這就好比給每個(gè)參賽選手提供相同的裝備和資源，讓比賽更加公平。如果蛋白量差異過大，就像有的選手負(fù)重過多，有的選手則輕裝上陣，會(huì)導(dǎo)致條帶的亮度和寬度出現(xiàn)明顯差異，影響后續(xù)的分析判斷。一般來說，對(duì)于全細(xì)胞裂解液，上樣量在 20 - 50 μg 較為合適；對(duì)于純化的蛋白，上樣量可以在 1 - 5 μg 。
如果有空置的泳道，一定要用等體積的 1x Loading Buffer 補(bǔ)齊，這一小小的舉動(dòng)卻有著重要作用。它能平衡電場，防止電場不均勻?qū)е伦詈蟮囊粌蓚€(gè)樣品條帶上揚(yáng)，就像給天平的兩端放上相同重量的砝碼，讓天平保持平衡。
在電泳過程中，也可能會(huì)遇到一些問題。比如，電壓過高，蛋白質(zhì)在凝膠中跑得過快，就像賽跑選手速度過快，容易失控，可能會(huì)導(dǎo)致條帶變形、分辨率降低；電壓過低，電泳時(shí)間過長，不僅浪費(fèi)時(shí)間，還可能會(huì)使蛋白質(zhì)擴(kuò)散，條帶變寬 。如果出現(xiàn)條帶彎曲或拖尾的情況，可能是凝膠制備不均勻，就像跑道坑洼不平，影響選手的奔跑；也可能是緩沖液離子強(qiáng)度不對(duì)，需要重新檢查緩沖液的配方并新鮮配制。
轉(zhuǎn)膜：蛋白轉(zhuǎn)移的精細(xì)操作
轉(zhuǎn)膜是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)中不可或缺的關(guān)鍵步驟，它肩負(fù)著將在凝膠中分離的蛋白質(zhì)精準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到固相膜上的重任，為后續(xù)的抗體檢測搭建起關(guān)鍵的橋梁。轉(zhuǎn)膜的原理基于蛋白質(zhì)的帶電特性，在電場的強(qiáng)大驅(qū)動(dòng)下，帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)從凝膠有序地遷移至膜上 。這一過程就像是一場精心策劃的搬遷行動(dòng)，讓蛋白質(zhì)從凝膠這個(gè) “臨時(shí)住所” 順利轉(zhuǎn)移到膜這個(gè) “新家”，并且在轉(zhuǎn)移過程中，蛋白質(zhì)能夠保持其在凝膠中的相對(duì)位置和分辨率，為后續(xù)的抗體識(shí)別和檢測奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
在轉(zhuǎn)膜方法的選擇上，主要有濕轉(zhuǎn)、快速濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)這幾種主流方式。常規(guī)濕轉(zhuǎn)，如同一場在 “水世界” 里的轉(zhuǎn)移之旅，通過制作 “海綿墊 - 濾紙 - 膜 - 凝膠 - 濾紙 - 海綿墊” 這樣的三明治夾板結(jié)構(gòu)，放入充滿轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)膜槽中，在電場力的強(qiáng)力作用下，蛋白質(zhì)從凝膠緩緩轉(zhuǎn)移到膜上 。它的優(yōu)點(diǎn)十分顯著，轉(zhuǎn)膜效果極為完全，就像搬家時(shí)所有物品都能被妥善安置，因此應(yīng)用廣泛，是眾多科研人員的常用之選。然而，常規(guī)濕轉(zhuǎn)也存在一些小缺點(diǎn)，所需時(shí)間較長，就像一場漫長的搬家過程，可能會(huì)耗費(fèi)較多的時(shí)間和耐心。而快速濕轉(zhuǎn)能在一定程度上解決時(shí)間長的問題，比如中科通儀就有相關(guān)的快速濕轉(zhuǎn)設(shè)備，能夠滿足一些對(duì)時(shí)間有更高要求的實(shí)驗(yàn)場景 。半干轉(zhuǎn)則與濕轉(zhuǎn)有所不同，它在固定膠 / 膜疊層及施加電場的儀器上另辟蹊徑。其優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)膜速度較快，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移，就像一場高效的快速搬家。但它也有不足之處，對(duì)于某些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)膜效率可能略低于濕轉(zhuǎn)，在轉(zhuǎn)移過程中可能會(huì)出現(xiàn)一些小狀況，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移效果不夠理想。
在轉(zhuǎn)膜過程中，有諸多注意事項(xiàng)需要我們格外關(guān)注。膜的選擇至關(guān)重要，Western Blot 實(shí)驗(yàn)中常用的轉(zhuǎn)印膜主要有 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）和 NC 膜（硝酸纖維素膜） 。PVDF 膜機(jī)械強(qiáng)度高，化學(xué)相容性好，靈敏度高，分辨率和蛋白親和力都很出色，尤其適合分子量較小的蛋白質(zhì)檢測，就像一把精準(zhǔn)的 “小蛋白探測器”。不過，它通常需要用甲醇 / 乙醇預(yù)先活化，在使用前需要多一道準(zhǔn)備工序。NC 膜則背景低，可結(jié)合蛋白質(zhì)和核酸進(jìn)行各種印跡應(yīng)用，是一種較為經(jīng)濟(jì)實(shí)用的選擇 。但它對(duì)于分子量較小的蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)容易丟失，且韌性較差，操作時(shí)需要格外小心，否則容易破碎。在選擇膜時(shí)，還需要考慮膜的孔徑大小。通常，Western Blot 轉(zhuǎn)印膜有 0.2μm 和 0.45μm 兩種孔徑 。0.2μm 的膜如同一張細(xì)密的濾網(wǎng)，更適合小于 20kD 的蛋白或低豐度蛋白的檢測；而 0.45μm 的膜則像是一張普通的濾網(wǎng)，更常用，適合大于 20kD 的蛋白。
在操作過程中，要小心避免氣泡的產(chǎn)生。氣泡就像隱藏在轉(zhuǎn)膜過程中的 “小搗蛋”，會(huì)阻礙蛋白質(zhì)的正常轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不均勻，出現(xiàn)條帶缺失或變形等問題。我們可以在組裝轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)時(shí)，用玻璃棒輕輕滾動(dòng)，將氣泡趕出，確保蛋白質(zhì)能夠順利轉(zhuǎn)移。
溫度的控制也不容忽視。轉(zhuǎn)膜過程中會(huì)產(chǎn)生熱量，如果溫度過高，就像給蛋白質(zhì) “蒸桑拿”，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，影響后續(xù)的檢測結(jié)果。我們可以使用冰袋或凝膠狀冷卻包來提供有效的降溫，讓蛋白質(zhì)在一個(gè)舒適的 “溫度環(huán)境” 中完成轉(zhuǎn)移。
電極方向的正確性也至關(guān)重要。如果電極方向接反，就像指南針指錯(cuò)了方向，蛋白質(zhì)不僅無法順利轉(zhuǎn)移，還可能會(huì)反向遷移，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。所以在轉(zhuǎn)膜前，一定要仔細(xì)檢查電極方向，確保萬無一失。
免疫檢測：精準(zhǔn)識(shí)別目標(biāo)蛋白
免疫檢測是 Western Blot 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它就像一場精準(zhǔn)的 “蛋白質(zhì)識(shí)別游戲”，利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，從眾多蛋白質(zhì)中精準(zhǔn)地找出目標(biāo)蛋白。這一過程就像是在茫茫人海中尋找特定的某個(gè)人，而抗體就是那把獨(dú)一無二的 “鑰匙”，能夠準(zhǔn)確地開啟目標(biāo)蛋白這把 “鎖” 。
在免疫檢測過程中，封閉是重要的第一步。封閉的目的是用無關(guān)蛋白填充膜上的空白位點(diǎn)，防止抗體非特異性結(jié)合，就像用填充物填滿房間的空隙，讓抗體只能與目標(biāo)蛋白結(jié)合 。常見的封閉液有 5% 脫脂奶粉和 3% BSA（牛血清白蛋白）。對(duì)于一般的蛋白質(zhì)檢測，5% 脫脂奶粉是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的選擇；而在檢測磷酸化蛋白時(shí)，由于奶粉中含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），可能會(huì)導(dǎo)致背景信號(hào)過高，所以更推薦使用 3% BSA 作為封閉液 。
抗體孵育是免疫檢測的核心步驟。一抗是與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體，它的濃度和孵育時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有著至關(guān)重要的影響?？贵w濃度過高，就像在房間里放了太多的人，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性結(jié)合增加，背景信號(hào)增強(qiáng)；抗體濃度過低，則可能會(huì)使目標(biāo)蛋白無法被充分識(shí)別，信號(hào)變?nèi)? 。孵育時(shí)間也需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，一般來說，室溫孵育 1 - 2 小時(shí)或者 4℃過夜孵育都是常見的選擇。4℃過夜孵育雖然時(shí)間較長，但可以讓抗體與目標(biāo)蛋白充分結(jié)合，提高檢測的靈敏度 。二抗是與一抗結(jié)合的抗體，它通常帶有標(biāo)記物，如辣根過氧化物酶（HRP）或熒光素，用于后續(xù)的信號(hào)檢測。二抗的選擇要與一抗的來源物種相匹配，比如一抗是小鼠來源的，二抗就應(yīng)該選擇抗小鼠的抗體 。
洗膜是免疫檢測過程中不可或缺的步驟，它的作用是去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗膜時(shí)要使用合適的洗膜液，如 TBST（Tris 緩沖鹽溶液加 Tween - 20）或 PBST（磷酸鹽緩沖鹽溶液加 Tween - 20） 。Tween - 20 是一種非離子表面活性劑，能夠降低表面張力，幫助去除非特異性結(jié)合的抗體 。洗膜次數(shù)一般為 3 - 5 次，每次 5 - 10 分鐘。洗膜不充分，就像衣服沒洗干凈，會(huì)殘留未結(jié)合的抗體，導(dǎo)致背景信號(hào)過高；洗膜過度，則可能會(huì)洗去部分與目標(biāo)蛋白結(jié)合的抗體，使信號(hào)減弱 。在洗膜過程中，要注意輕輕晃動(dòng)容器，讓洗膜液充分接觸膜的表面，確保洗膜效果均勻一致。
總結(jié)
Western Blot 實(shí)驗(yàn)全流程涵蓋了樣本制備、凝膠制備、電泳、轉(zhuǎn)膜以及免疫檢測等多個(gè)關(guān)鍵步驟，每一個(gè)步驟都如同精密儀器中的一個(gè)部件，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)偏差，都可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。從樣本制備時(shí)對(duì)裂解液的謹(jǐn)慎選擇，到凝膠制備中對(duì)濃度、聚合時(shí)間的嚴(yán)格把控；從電泳時(shí)對(duì)蛋白上樣量和電壓的精準(zhǔn)調(diào)控，到轉(zhuǎn)膜時(shí)對(duì)膜的類型、孔徑以及轉(zhuǎn)膜條件的細(xì)致考量；再到免疫檢測中對(duì)封閉液、抗體孵育和洗膜的精心操作，每一處細(xì)節(jié)都承載著實(shí)驗(yàn)成功的希望。
在實(shí)際操作中，大家要充分理解每個(gè)步驟的原理和要點(diǎn)，嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作，并且不斷積累經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖咎攸c(diǎn)，靈活調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件。只有這樣，我們才能在這個(gè)充滿挑戰(zhàn)的實(shí)驗(yàn)過程中，獲得準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。希望大家在今后的科研道路上，通過不斷地探索和實(shí)踐，能夠熟練掌握 Western Blot 實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為科研工作的順利開展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在蛋白質(zhì)研究的領(lǐng)域中收獲更多的成果。
